Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Отбор образцов сыворотки. Через 4-5 недель после вакцинации проводят забор крови у мышей под анестезией. Сыворотки до определения содержания антител хранят при -200С.
Определение антител. Выполняют количественное определение содержания специфических в отношении каждого из компонентов антител в сыворотках с
использованием метода с подтвержденной достоверностью, например, ELISA, методика которого приведена ниже.
Испытание ELISA. Титрационные микропланшеты, выполненные из поливинилхлорида или полистирола, в соответствии с требованиями специфического антигена, покрывают очищенным антигеном в концентрации 100 нг на одну ячейку. После промывки непрореагировавшие участки блокируют путем инкубации с раствором бычьего сывороточного альбумина и последующей промывки. Производят на планшетах двукратные разведения сывороток мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и вакциной сравнения. После инкубации при 22-250С в течение 1 часа планшеты промывают. После промывки добавляют хромогенный субстрат, высвобождающий под воздействием присоединенного ферментного конъюгата хромофор, который может быть количественно определен путем измерения оптической плотности (2.2.25). Выбирают такие условия испытания, чтобы в рабочем диапазоне измерений имелась линейная зависимость оптической плотности от содержания антител, а значения оптической плотности находились в пределах от 0,1 до 2,0.
В испытании используется контрольная антисыворотка установленной активности, служащая основанием для вычисления содержания антител в испытуемой сыворотке. Также в испытании используется стандартизированная контрольная сыворотка.
Результаты испытания являются недостоверными, если:
- значение, определенное для контрольной сыворотки, отличается от приписанной величины более чем на удвоенное значение стандартного отклонения,
- доверительный интервал оценочного значения активности шире, чем от 50 до 200%.
Вычисления. Вычисляют титры антител в сыворотках мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и препаратом сравнения, и из полученных значений с использованием обычных статистических методов определяют активность испытуемой вакцины относительно вакцины сравнения.
2.7.17. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТРОМБИНА III ЧЕЛОВЕКА
Содержание антитромбина III в испытуемом препарате определяют путем сравнения его способности к инактивации тромбина в присутствии избыточного количества гепарина с такой же способностью препарата сравнения антитромбина III человека, калиброванного в Международных Единицах. Различные количества испытуемого препарата смешивают с определенным количеством тромбина и определяют активность остаточного количества тромбина с использованием подходящего хромогенного субстрата.
За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта концентрата антитромбина III человека. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Методика определения. Готовят два независимых ряда из трех или четырех разведений испытуемого препарата и препарата сравнения в диапазоне от 1/75 до 1/200 исходя из концентрации 1 МЕ/мл с использованием буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R, содержащего 15 МЕ гепарина в миллилитре.
По 200 мкл каждого из разбавлений выдерживают при 370С в течение 1-2 минут. К каждому разведению добавляют по 200 мкл раствора бычьего тромбина R с содержанием 2 МЕ/мл в буферном растворе tris-EDTA BSA рН 8,4 R, перемешивают и выдерживают при 370С в течение в точности 1 минуты. Добавляют 500 мкл подходящего хромогенного субстрата (например, й-фенилаланил-L-пипеколил-Ь-аргинина 4-нитроанилида, растворенного в воде R с получением раствора, содержащего 4 ммоль/л и дополнительно разбавленного до концентрации, подходящей для проведения количественного определения с использованием буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R без добавления альбумина). Тотчас же начинают фиксировать изменение оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), и продолжают измерение в течение не менее 30 секунд. Вычисляют скорость изменения оптической плотности (ДА/мин). (Определение также может производиться методом конечной точки путем прерывания реакции добавлением уксусной кислоты и измерением оптической плотности при длине волны 405 нм.)
Скорость изменения оптической плотности (ДА/мин) обратно пропорциональна активности антитромбина III.
Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).
2.7.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ II
Количественное определение фактора свертывания крови II производят по его специфической активации с образованием фактора IIa. Фактор IIa оценивают на основании сопоставления его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.
